JA.WEBZDARMA.CZ - Texty - Polymerázové řetězová reakce
Polymerázové řetězová reakce
Naposledy upraveno: 05.06.2008 18:44:54

Jeden z technických problémů diagnostiky pomocí polymerázové řetězové reakce.
D.Hulínská,J.Votýpka
Státní zdravotní ústav Praha


Přesná metoda nesnáší improvizaci.
Nadšení z netušených možností polymerázové řetězové reakce(PCR) již prožila většina mikrobiologů. Především těch, kteří mají co do činění s druhy těžce kultivovatelnými a rozpoznatelnými při použití klasických mikrobiologických metod. Komerční sety zbaví mikrobiology řady problémů , zklamání z neúspěchu a dávají jistotu reprodukovatelných a srovnatelných výsledků . Když se mikrobiolog spolehne na již vyzkoušené soupravy musí bezpodmínečně dodržet všechny požadavky firemního postupu.Při stále lákavější nabídce výrobců a dodavatelů se občas stane , že ke změnám podmínek reakce dojde nejčastěji tam, kde to laboratorní pracovník považuje za „bezvýznamné“.Jako příklad bych uvedl záměny plastikových amplifikačních zkumavek o objemu 0,2 ml používané v termálních cyklerech.Experimentátor považuje tyto výrobky od různých výrobců za zaměnitelné a některé jejich tvarové a materiálové variace, spíše za konkurenční odlišnost než funkční záležitost.Přitom použití různých druhů těchto nádobek může zásadním způsobem ovlivnit výsledek.Dosažené výsledky podle druhu zvolené zkumavky může považovat za inhibici,dokonce i za kontaminaci podle toho jaký výsledek očekával, na jaký výsledek byl před změnou zkumavek zvyklý.Ten kdo si neumí vysvětlit své výsledky pak může propadnout malomyslnosti,případně zavrhnout i metody PCR diagnostiky vůbec ,případně prožít nezáviděníhodný vědecký život mezi nevysvětlitelnými výsledky.

PCR jako tanec mezi inhibicí a kontaminací.
Vysoká citlivost PCR je výhodou i nebezpečím. Výhodou je,že dobře pomáhá při identifikaci hledaného, nebezpečná je citlivost reakce ke kontaminaci a vzniku falešně pozitivních výsledků. Kritickými místy , kde může vznikat kontaminace jsou : příprava DNA ze vzorků, příprava mixu a manipulace s amplifikátem obsahujícím velké množství syntetizovaných kopií DNA. Oddělené prostory pro přípravu DNA,mixu i pro práci s amplifikátem,sterilizace pipet, špiček, a vyzařování prostoru jsou již běžně používaná ochranná opatření ve všech laboratořích. Navíc ke snížení možné kontaminace přispívá používání komerčních mixů a jejich variant pro přímou prevenci před kontaminací plynoucí z produktů PCR (PCR carry-over prevention). Při velkém počtu reakcí,které má možnost naše laboratoř hodnotit a při desetileté zkušenosti s nejrůznějšími materiály od různých výrobců dospěli, jsme k zajímavému dílčímu zjištění v oblasti,které se většinou přílišná pozornost nevěnuje – PCR zkumavkám.

Vliv mikrozkumavek a jejich uzávěrů.
Méně často je studován vliv používaných zkumavek a typ jejich uzávěrů na možnou kontaminaci.Objem reakčních směsí s templátem pro amplifikaci v cykleru je rutinně doporučován v množství 100-50 mikrolitrů. Při použití vzorku pod 25 mikrolitrů upozorňují výrobci již na problémy s reprodukovatelností výsledků, bez dalšího vysvětlení. Řada pracovníků využívající PCR vám potvrdí, že právě menší objemy přinášejí očekávané výsledky a přirozeně též zlevňují reakci. Právě při používání menších objemů, si však také častěji a lépe všimnete úbytku objemu po proběhlé reakci než při objemu velkém, stejně tak při delším zahřívání směsi a při vyšší teplotě například při horkém startu. V těchto případech je zřejmé,že část reakční směsi se během reakce odpařila přesto,že tomu má zabránit vyhřívané víčko a těsnost uzávěru zkumavky. Dříve před érou vyhřívaných víček cykleru se používalo převrstvení reakční směsi olejem, který zabraňoval odpařování. Vyhřívané víko cykleru, většinou je zahříváno na teplotu o 10 stupňů nad nejvyšší použitou teplotu v programu, zabraňuje zcela kondenzaci par na víčku reakční zkumavky. Nezabraňuje však ve všech případech úniku par z reakční směsi a ze zkumavky. Vysoká teplota víka cykleru naopak při netěsnosti víčka, při nedostatečném tlaku , při nevhodně zvolené konzistenci zkumavek,a tvaru víčka zkumavky, přispívá k rychlejšímu odparu přehřátých par z reakční směsi. Pomocí unikajících par se pak dostávají ze zkumavky též již molekuly amplikonu, které mohou kontaminovat okolí. Je již jen otázkou času a fyzikálních zákonů při kolísání teplot během probíhajícího programu, kdy se kontaminující molekuly dostanou do sousedících zkumavek a způsobí „ nevysvětlitelnou“ pozitivní reakci,kterou si však nemusí pracovník vůbec připustit, neboť kontroly mohou být negativní, stejně tak řada sousedících vzorků . Pracovníci zvyklí na „svou obvyklou“ četnost pozitivních výsledků mohou považovat omylem ochranná opatření snižující tento typ kontaminace za vliv inhibice,za snížení citlivosti způsobenou materiálem atd.Tak může dopadnout neobjektivní hodnocení ve smyslu snížení citlivosti při zavedení preventivního systému dUTP-uracil DNA glykosylasy, při snížení počtu cyklů programu,při vyřazení silné pozitivní kontroly, při přechodu od horkého startu ke startu studenému, při výměně PCR zkumavek s plochými víčky za vypouklá, při zvyšujícím se objemu reakční směsi. Vše výše uvedené má jistě i zdůvodnitelnou nižší pozitivitu také z jiného důvodu,než je únik pozitivních amplikónů během programu přímo v cykleru. Charakteristickým rysem pro kontaminaci v cykleru je situace, kdy je velmi těžké reprodukovat výsledky amplifikace při větším počtu vzorků z původní DNA.

Nejlépe přesvědčí vlastní pokus.
Mimo závěry z pozorování průběhu a výsledků při amplifikaci DNA posloužily k podpoře našeho podezření i výsledky jednoduchých pokusů, týkajících se pevnosti víček mikrozkumavek během amplifikačního programu a podmínek při kontaminaci vzorků během termálního programu v cykleru Pro porovnání těsnosti víček 0,2 ml mikrozkumavek používaných v cyklerech byly vybrány dva druhy.Jednotlivé druhy se lišily tvarem víčka. Jedno bylo ploché, příjemné pro snadnější popis vzorků a druhé vypouklé ve tvaru bubliny. Pro pokus byly vybrány výrobky jedné firmy OXYGENRScientific. O,2 ml PCR zkumavky s plochým víčkem - (Flat Top PCR-02-C) a s vypouklým víčkem (Domed Cap PCR-02D-C). Byly použity dvě zkumavky obou druhů. Do každé zkumavky bylo napipetováno po 100 mikrolitrech barevného vazebného roztoku (Gel Loading Solution 6x koncentrovaný SIGMA).Víčka byla řádně zavřena a zkumavky vloženy do 200 ml destilované vody v 500 ml skleněné erlenmayerově baňce. V dvou baňkách odděleně zkumavky s plochými a vypouklými víčky. Tekutina v baňkách byla zahřáta k varu a var udržován po dobu 5 minut. Během této doby se baňka s mikrozkumavkami s plochými víčky zbarvila modře, neboť po cca jedné minutě došlo k otevření zkumavky s plochým víčkem. Po vychladnutí byla provedena kontrola zkumavek. Test těsnosti za varu dopadl velmi dobře u zkumavek s vypouklými víčky, žádná ze zkumavek se neotevřela, voda se neobarvila a po zchladnutí nebyla voda vzniklým podtlakem se nedostala do zkumavky, objem jejich obsahu zůstal stejný jako před pokusem. U mikrozkumavek s plochými víčky to dopadlo naopak špatně. Jedna zkumavka se otevřela již během varu, voda se obarvila a druhá zkumavka následkem netěsnosti nasála během chladnutí okolní vodu k barevnému vazebnému roztoku. V této zkumavce tak byl dvojnásobek objemu než jaký byl do ní napipetován před pokusem. (obr.č.1)Výsledek je jasný. Zkumavky s plochým víčkem méně těsní již při zahřívání při 100 C. Při zahřívání v cykleru je vystavena zkumavka i 15 minutám zahřívání při 105 o C a 35 minutám při 104 o C použijeme-li metodu PCR s horkým startem.I když je víčko fixováno tlakem víka cykleru je pravděpodobné, že v některých zkumavkách dochází k netěsnostem během zahřívání a kolísání teplot podle zadaného programu a úniku i nasátí produktu do dalších zkumavek a k možné kontaminaci jinak negativních vzorků .

Další pokus upozorňuje na únik par v cykleru.
Pro průkaz přímé kontaminace negativních vzorků v cykleru při použití těsnících i netěsnících zkumavek byl použit jednoduchý orientační pokus. Byly srovnány výsledky z amplifikace pozitivního vzorku obklopeného v jedné nejbližší řadě mixem bez pozitivního templátu, který byl nahražen destilovanou vodou u dvou druhů zkumavek s rozdílnými víčky. Byl použit komerční Master Mix HotStar QIAGEN, primery OSPA2 (Mannak). Pozitivním templátem byla DNA Borrelia burgdorferi sensu stricto ,kmen B31 izolovaná po kultivaci v BSK mediu SIGMA.Koncentrace DNA v templátu byla 3,7 mikrogramů v 1 ml,čistota 1,8 .Při přípravě DNA nebyla použita RNáza . Použili jsme 0,2 ml mikrozkumavek AXYGEN s plochými a vypouklými víčky. Objem byl vždy 25 mikrolitrů mixu, který u pozitivních vzorků obsahoval 60ng DNA Borrelia burgdorferi. V negativních vzorcích byl templát nahražen 6 mikrolitry destilované sterilní vody.Teplotní profil reakce byl 95 o C po dobu 15 minut , 35 krát denaturace při 94 o C 30 vteřin, annealing 68 o 30 vteřin a elongace 72 o C 60 vteřin.
Závěrečná elongace v jednom cyklu 5 minut při 72 o C. Víko cykleru bylo v jedné části pokusu vyhříváno stabilně pro teplotu 105 o C a v druhém případě kopírovalo víko změnu teploty s tím,že bylo vždy vyhříváno o 10 o C výše než byla teplota probíhajícího teplotního kroku programu. Pro pokus byly použity dva termální cyklery PTC 200 MJ RESEARCH a T –Gradient BIOMETRA. 10% produktu bylo vizualizováná v 1,5 % agarozovém gelu v 1x TAE pufru, barvenéme thidiumbromidem po elektroforéze 2V/cm 2 60 minut.Velikost specifického produktu amplifikace byla 445 bp. Velikostním markerem byl DirectLoad Wide Range DNA Marker SIGMA (50-10000bp).Negativní kontrolou byly zkumavky s plochým víčkem ve stejném uspořádání jako výše popsaná sestava jen s tím rozdílem, že obsah je překryt ve zkumavce 50 mikrolitry parafínového oleje.Výsledek při použití předepsaných 35 cyklů byl negativní při použití netěsnících zkumavek s přelitým olejem .U netěsnících zkumavek bez parafínového oleje došlo ke kontaminaci a produkci specifického produktu ,stejného jako v pozitivní kontrole, lehce simulujícího pozitivní reakci.(viz obr.3)Chceme-li můžeme stanovit i procento úniku odpařeného mixu z netěsnících zkumavek přímo v cykleru.Naplňte 0,2 ml PCR zkumavku 100 mikrolitry mixu,pečlivě uzavřete víčka, vložte je do cykleru a použijte program pro horký start s 35 cykly. Po proběhlém programu zkumavky z cykleru vyjměte a zkontrolujte. V těsnících zkumavkách bude celý objem tj. 100 mikrolitrů nejspíš přímo na víčku ve formě kapky.U těch zkumavek,kde není těsnost víček stoprocentní pak najdeme ve zkumavce tolik mikrolitů roztoku, kolik odpovídá procentu těsnosti. A u těch zkumavek, kde nenalezneme žádnou tekutinu, ty netěsní vůbec.Poslední případ se nám podařil v poslední době u zkumavek jedné renomované firmy, kterou raději ani nebudeme uvádět.

Použitelná prevence.
V prvé řadě doporučujeme si jednoduše vyzkoušet použivané mikrozkumavky a poté vždy, když přecházíte na jiný druh nebo výrobek od jiné firmy. Za druhé můžete využít níže uvedené doporučení. Naše pozorování nás dovedlo k závěru, že je možné zabránit kontaminaci přímo v cykleru dodržením následujícího jednoduchého postupu: Po napipetování reakční směsi a templátu do zkumavky je nutné překrýt směs alespoň 40 mikrolitry (při použití 0,2 ml zkumavek) sterilního parafínového oleje. Totéž se týká pozitivních kontrol i kontrol negativních. Zkumavky je třeba pak krátce centrifugovat při 6000g jednu minutu.Toto se provádí i pro cyklery s vyhřívaným víkem, stejně tak jak se to činilo před jejich érou i když z jiného důvodu. Tento postup je možné použít jak u mixů se startem horkým i studeným u cyklerů s vyhřívaným víkem i bez něj, bez problémů je možné používat vrstvu pod olejem pro identifikaci produktu v agarozovém gelu .Při použití oleje nerozhoduje typ zkumavky a tvar jejího víčka.Pozitivní výsledky budou pouze u těch vzorků,kam byl vnesen pozitivní templát před umístěním zkumavky do cykleru.Postup zvěrohodní výsledky vaší pečlivé práce a přinese vedle užitku a vědecké pravdy i vám radost z dobré práce. Je možné použít jakýsi kompromis s poměrně dobrým i když ne se stoprocentním výsledkem. Je možné použít oleje jen pro pozitivní kontrolu a zařadit více negativních kontrol.

A něco i pro ty co dělají vše dobře.
Kdo by se nechtěl vracet k používání oleje ten musí zvolit zásadně dobře těsnící PCR zkumavky, nejlépe s vypouklým víčkem, volit nejslabší možné pozitivní kontroly, používat Carry-Over prevenci, objemy 50-100 mikrolitrové a často degradovat případné amplikony z prostoru cykleru.Kdo by nerespektoval jedno ani druhé tomu přejeme radost z četných pozitivních výsledků, tak jak na ně byl jistě zvyklý dodnes.



Obraz 1.: Vliv patnáctiminutového varu na PCR mikrozkumavky obsahující 100 ul barevného roztoku.Vpravo těsnící zkumavky s vypouklými víčky,vlevo zkumavky s plochými víčky.Vlevo:u zkumavek s plochými víčky došlo v jenom případě otevření a vylití obsahu (průhledná zkumavka) v druhém případě díky netěsnosti k nasátí okolní tekutiny čímž byl původní obsah barevného roztoku zvětšen z 100 mikrolitrů na cca dvojnásobek.(Zkumavka zcela naplněná barvivem)


Obraz 2.:Odpar z PCR zkumavek těsnících a netěsnících. Vlevo nahoře: Nestejný objem mixu po amplifikaci u nestandardně těsnících zkumavek
Vpravo nahoře: Zachovaný objem u zkumavek se standardně těsnícími víčky
Vlevo dole: Zkumavky s uměle vyvolanou netěsností mikrovpichem po amplifikaci stejného ; množství mixu jako v jiných zkumavkách na obrázcích.
Vpravo dole: Zkumavky s umělým mikrovpichem a převrstvením parafinovým olejem po amplifikaci.


Obraz 3.: Průkaz kontaminace netěsnících PCR zkumavek na elektroforéze produktu Primer OSPA pro Borrelia burgdorferi sensu lato,produkt 445 bp,barveno ethidiumbromidem
Jamky odzhora dolů:
1. - pozitivní kontrola templát DNA Borrelia burgdorferi sensu stricto kmen B31
2. - vynecháno
3. - DNA marker Sigma 50-10 000 bp
4. - negativní kontrola kde templát byl nahrazen sterilní destilovanou vodou- netěsnící zkumavka
5. - negativní kontrola kde templát byl nahrazen sterilní destilovanou vodou- netěsnící zkumavka
6. - vynecháno
7. - negativní kontrola kde templát byl nahrazen sterilní destilovanou vodou- těsnící zkumavka
8. - negativní kontrola kde templát byl nahrazen sterilní destilovanou vodou- těsnící zkumavka
9. - vynecháno
obsah: Copyright © 2008 Jíří Antonín Votýpka ; redakční systém: Copyright © 2008 Yotto.cz