JA.WEBZDARMA.CZ - Texty - Průkaz DNA původců lymeské borreliózy
Průkaz DNA původců lymeské borreliózy
Naposledy upraveno: 16.12.2009 08:23:41

Průkaz genomové a plasmidové desoxyribonukleové kyseliny Borrelia burgdorferi sensu lato pomocí multiplex polymerázové řetězové reakce s horkým startem.

Hulínská D.,Votýpka J.,
Národní referenční laboratoř pro lymeskou borreliózu Centra epidemiologie a mikrobiologie Státního zdravotního ústavu v Praze


Klíčová slova: Multiplex PCR – DNA Borrelia burgdorferi

Souhrn.

Autoři předkládají skreenigový test při němž se pomocí jednokrokové polymerázové řetězové

reakce (PCR) prokáže v materiálu přítomnost genomové i plasmidové deoxyribonukleové




kyseliny(DNA) spirochéty Borrelia burgdorferi sensu lato (Bb) v tělních tekutinách i

ve tkáních.Test je dostatečně citlivý, prokáže již čtyři spirochéty ve vzorku. Test využívá

metodu horkého startu,čímž se zvyšuje specifičnost i výtěžek reakce.Identifikací sekvence

z geneticky stabilní oblasti genu 16S rRNA zároveň s průkazem plasmidové DNA

z genu pro OSPA se snižuje riziko falešně pozitivních výsledků v přítomnosti DNA obecně

rozšířených bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. V jednom testu lze navíc odečítat u

lidských vzorků i kvalitu provedené izolace DNA a přítomnost inhibitorů reakce. Test značně

zužuje výběr vzorků pro další identifikaci produktu PCR, šetří čas i peníze.






Úvod.

Polymerázová řeťězová reakce se dnes používá pro identifikaci deoxyribonukleové kyseliny

řady mikroorganismů. U některých virů a bakterií byla jejich diagnostika standardizována a

ve formě komerčně vyráběných setů je využívána v klinické praxi.U řady dalších lidských

patogenů obecnému zavedení této molekulárně-genetické diagnostiky brání některé

okolnosti.Odráží se v nich problémy s nimiž se laboratorní praxe setkává.Nicméně materiálně

a personálně vybavená pracoviště celého světa se snaží dovést i jejich diagnostiku do stadia

bezproblémového využití .Diagnostika spirochéty způsobující lymeskou borreliózu (LB)druh

Borrelia burgdorferi. je toho příkladem. Od objevení původce onemocnění a brzy po

zavedení PCR reakce jsou publikovány stovky postupů využívajících této metody. Jednotlivé

návrhy se liší použitím různých způsobů izolace DNA, využitím originálních sekvencí





oligonukleotidů, modifikací PCR metody. Každá nová metodika řeší nějaký problém,bohužel

často přináší i nové obtíže.Hlavními problémy u průkazu Bb pomocí PCR reakce jsou: malé

množství spirochét v tělních tekutinách- [ 5..Schmidt,1997] i malé množství DNA

v chromozomu spirochéty (6 x menší než u Escherichia coli).

Tabulka 1.

Také s přítomností spirochét se setkáváme v organismu jen v krátkých časových intervalech

Problémem může být při vystupňované citlivosti reakce i skutečnost,že některé sekvence

genomu spirochéty jsou podobné obecně velmi rozšířeným fekálním bakteriím z čeledi

Enterobacteriacae. A aby byla smůla dovršena připravuje se enzym pro PCR reakci právě

produkčními kmeny z této skupiny bakterií především za použití druhu Escherichia coli a

není neobvyklé,že roztok tohoto enzymu obsahuje jisté množství jeho DNA. Navíc i

deionizovaná voda nedostatečně tepelně sterilizovaná může obsahovat DNA například rodu

Pseudomonas a jiných bakterií patřících mezi enterobakterie. Nepřítomnost obecně




použitelného testu PCR pro původce lymeské borreliózy trápí mikrobiology již desítky let.

Chceme využít svých zkušeností a pomoci tak kolegům – klinikům k přesné laboratorní

diagnostice lymeské borreliózy.


Materiál a metody.


Příprava templátové DNA

Pro reakci bylo použito 10-20 % (v/v) templátu připraveného pomocí komerčního setu

DNasy Tissue Kit QIAGEN (kat.č. 69506) pro zvířecí materiál a QIAamp DNA Mini Kit

QIAGEN (kat.č. 51306) pro lidský materiál,vždy podle protokolu k přípravě DNA

z gramnegativních bakterií. Tekuté vzorky byly koncentrovány centrifugací při teplotě 4º po

dobu 20 minut při odstředivé síle 6000g.U materiálu, který obsahoval malé množství bílkovin

a buněčných elementů (mozkomíšní mok,moč,voda a výplachy) byla použita k přípravě DNA

alkalická lýza - koncentrovaný pelet buněk byl zahříván v 50 mM NaOH 15 minut při 95 ºC,

následně upraveno pH na 7,0 šestnácti procenty roztoku 1M Trisu o pH 7,0 [ 3. Priem,S.,at

all.1997].

Směs pro amplifikaci

Používaná směs pro reakci byl komerční HotStarTaq Master Mix (QIAGEN kat.č.203445)

Směs v konečné koncentraci obsahovala 2,5 jednotek HotStar Taq DNA polymerázy

(rekombinantní 94-kDa DNA isolované z Thermus aquaticus, klonované v Escherichia coli)

s PCR pufrem (Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4, o pH hodnotě 8,7) .obsahující dále 200 µM

každé base dNTP, a s koncentrací chloridu hořečnatého 2,0 mM. Amplifikační směs

obsahovala 1,0 µM setu genomového primeru LD-16SrRNA gen[ 2.Marconi 1992] LD+

5´-ATg CAC ACT Tgg TgT TAA CTA-3, LD- 5´-gAC TTA TCA CCg gCA gTC

TTA-3 a .0,5 µM setu primeru plastidového OSPA -OSPA gen [1.Mannak,1997] L5+ 5´-

Tgg ATC Tgg AgT ACT TgA Agg CgT-3, R5- 5´AgT gCC TgA ATT CCA AgC

TgC AgT-3 Jako ředilo byla používána výhradně autoklávováním sterilizovaná voda pro

PCR.(Roche,Qiagen,Aqua pro injectione Biotika) Do směsi se přidá 20 % roztoku templátu

s maximální koncentrací celkové DNA nižší než 100 µg /1ml ,obvykle 0,5 až 3 µg /1ml, u

DNA izolované z tkání s koncentrací až desetinásobně vyšší.. U templátů připravených

alkalickou lýsou se přidává tekutý templát do koncentrace 15% .Reakci provádíme v 0,2 ml

PCR zkumavkách s vypouklými víčky a s prodlouženým lemem víčka , nejlépe určenými pro

horký start. Po napipetování 20 µl mixu přidáváme 5 µl templátu a centrifugujeme při

6000g/60 vteřin. Chceme-li vložit interní kontrolu přípravy DNA u humáních vzorků

přidáme do mixu ještě set primerů pro identifikaci beta-globulinu -gen lidského beta-

globulinu [4.Saiki,1986 ] PC 03 5ACA CAA CTg TgT TCA CTA gC -3 a PC 04

5- CAA CTT CAT CCA CgT TCA CC - 3 v koncentraci 0,3 µM .Je však třeba mít na

mysli,že přítomnost dalších konkurenčních primerů, především s kratším produktem může

snižovat citlivost reakce.






Teplotní profil amplifikace.

PCR reakce byla prováděna pomocí termálního cykleru PTC 200 MJ Research a Biometra

T – gradient s Peltierovými články a vyhřívanými víčky.Víčko bylo vyhříváno buď

kontinuálně na 105º C(Biometra), nebo jeho teplota kopírovala cyklus vždy s teplotou o 10

ºC vyšší než byla teplota probíhajícího kroku programu. Vybraný program je uveden v tabulce

č.2.

Tabulka 2.

Identifikace produktu PCR

Po proběhlé amplifikaci v cykleru, se mikrozkumavky centrifugují (při 6000 g 1 minutu) a

nejlépe ihned se smíchá obsah zkumavky s vazebným roztokem 6x koncentrovaným tj.

v poměru na jeden díl vazebného roztoku šest dílů amplifikovaného roztoku. Deset procent

obsahu zkumavky použijeme pro jednu jamku 1-2 % agarozového gelu při elektroforetické

separaci PCR .Agaróza obsahuje 0,2mg% ethidum bromidu. Při elektroforéze v 1x

koncentrovaném trisacetátovém pufru s pH 7,5 při stejnosměrném proudu 2-4 V/cm

identifikujeme polohu produktů v UV. Při menší šíři agarozového gelu nebo při déle trvající

elektroforéze je nutno gel dobarvit ve vodném roztoku ethidium bromidu(EtB) (5mg% v/v),

neboť Etb putuje v agarozovém gelu opačným směrem než nukleové kyseliny a část gelu se

může zcela odbarvit.Po dobarvení (cca 10 minut ) vymýváme přebytečný EtB chladnou

vodou 30-60 minut. Teprve poté fotografujeme na transiluminatoru v UV světle na černobílý

negativní film o citlivosti 100 ASA, při cloně 5,6 po dobu 15 vteřin.Po vyvolání negativu,

zhotovení dostatečně velkých zvětšenin (18x24 cm) ne příliš kontrastně vyvolaných,a jejich

usušení hodnotíme výsledky. Stanovíme podle velikostního markru (použit Wide Range

DNA Marker 50-10000 bp,Sigma D 7058 ) velikost produktu pozitivní kontroly (při

popsaném postupu lze rozlišit rozdíl až 3 bp), která musí být shodná s velikostí specifických

produktů zkoumaných vzorků. V případně námi použitých primerů se jednalo o produkty

357 bp pro LD primer a 448 bp pro OSPA primer.V negativní kontrole nesmí být zjistitelný

žádný produkt, a to jak v negativní kontrole tvořené ředidlem mixu tak v kontrole negativní

hostitelské DNA (Při vyšetřování lidských klinických vzorků je to DNA od zdravého jedince,

u zvířecích vzorků musí negativní vzorek odpovídat druhu vyšetřovaného zvířete).Pozitivní

kontrolou byla DNA izolovaná z kmene B31 Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia

garinii ( M 192) Borrelia afzelii (Kc90) Při použití vnitřní kontroly přípravy DNA

odečítáme ještě produkt ve velikosti 110 bp.Při hranici viditelnosti produktu na gelu

barveném EtB 1 ng a při počtu 20 výchozích kopií produktu dostaneme po 30 cyklech při 85

% účinnosti kolem 2 miliard kopií což je nejméně 10µg v 1 µl amplifikátu,. Toto množství je

již dostatečně zřetelné na agarozovém gelu i po dostatečném odstupu od gelové jamky.Tento

odstup je nutný pro přesnější odlišení velikosti produktu.Pozitivní produkt byl následně

verifikován pomocí primerů OSPA a OSPC sekvencí.(Viz následující sdělení)

Výsledky .

V letech 2002-2004 bylo vyšetřeno 5198 vzorků lidského i zvířecího materiálu pomocí

skrenigového testu PCR multiplex. U všech těchto vzorků byla zároveň odečítána pozitivní

reakce plasmidové i genomové DNA BB. Z celkového počtu zpracovaných vzorků bylo 10,8

% pozitivních. Výsledky jsou přehledně uvedeny v tabulce č.3.

Tabulka 3

Neměli jsme možnost porovnat tento výsledek s kontrolní negativní skupinou zdravých dárců,

neboť materiál zasílaný do naší laboratoře je již označen jako suspektní na průkaz LB.LB

v nejlepším případě jde o vzorky u kterých se vylučuje lymeská borrelióza.V dalším sdělení

bude toto vyšetření doplněno..


Specificita

Autoři použitých primerů uvádějí též výsledky testů jejich specifity .Běžně se testuje DNA

nepatogenních druhů rodu Borrelia. Sami jsme si ověřili i specifitu reakce testováním DNA

řady běžných bakteriálních druhů a některých DNA virů.Testy vyhověly, viz tabulka 4. U

těch druhů bakterií u kterých lze nalézt stopová množství produktu stejné velikosti jako u BB

jsme zjistili,že nespecifický produkt vzniká pouze při velmi vysoké koncentraci DNA

kontaminujících bakterií. Takové vysoké koncentrace není možné prakticky nalézt

v klinickém materiálu. Problémem však může být použití polymerázy s vyšším obsahem

DNA Escherichia coli Tento mikroorganismus se používá jako produkční kmen při výrobě

většiny polymeráz pro PCR Riziko se dá eliminovat použitím speciálních polymerát s nízkým

obsahem DNA produkčního kmene.Příkladem může být nově zaváděná „LD-Low DNA“

AmpliTaq Gold DNA Polymerase LD od firmy Applied Biosystéme,nebo firmy TAKARA a

jiných. Záludnýn problémem může být používání nevhodné destilované vody jako ředidla pro

mix PCR. Deionizovaná voda většinou obsahuje větší množství koliformních bakterií a ani

následná sterilizace nemusí odstranit všechnu přítomnou DNA.Takováto voda použitá pro

PCR mix může přispět k produkci nespecifického produktu,hlavně při používání primerů

odvozených od 16Sr RNA genu.Ze získaných poznatků je zřejmé, že k identifikaci je nutné

použít vždy několik primerů s odlišnými sekvencemi.Dále je nutné důsledně používat u

pozitivních vzorků další identifikaci produktu pomocí druhově specifické hybridizační

sondy,případně restrikční analýzu nebo sekvenci produktu.V tabulce nejsou uvedeny všechny

zkoušené organismy,jejichž DNA byla vyšetřena specifickými primery pro Borrelia

burgdorferi. Jedná se o následující druhy: Legionella pneumophila, Anaplasma

phagocytophilum,Human herpes 1 simplexvirus,Human herpes 2 simplex virus a Human

herpes 4 lymphocryptovirus, Human herpes 5 cytomegalovirus a DNA 30 izolátů blíže

neidentifikovaných bakterií, které kontaminovaly vzorky při kultivaci borrelií v BSK mediu

z lidských i zvířecích vzorků.Vyšetření výše uvedených druhů DNA bylo při použití

používaných primerů k průkazu agens lymeské borrelliózy negativní

Tabulka 4.

Diskuse.

Při použití jednokrokové polymerázové řetězové reakce pro identifikaci specifické

DNA spirochéty způsobující lymeskou borreliózu Borrelia burgdorferi sensu lato je třeba

použít několik vybraných primerů jejichž souběžná pozitivita výrazně zvyšuje věrohodnost

testu.Navíc se velmi zúží výběr vzorků, které poté jsou podrobeny další analýze produktu

PCR .Vybrali jsme kombinaci primerů identifikujích sekvence genomové a plasmidové DNA

BB.Primer genomové DNA byl odvozen ze sekvence genu 16S r RNA plasmidový primer

byl odvozen z genu OSPA .Kombinace primerů nám napomáhala v jedné reakci odlišit

přítomnost plasmidové DNA identifikující akutní aktivní stádium invadující infekce Bb,

za předpokladu přítomnosti i genomové DNA.Další výhodou bylo odlišení podobných

sekvencí některých koliformních bakterií,které mohou být přítomné ve vyšetřovaných

vzorcích.(Negativní plasmidová DNA, velmi slabá reakce genomové DNA). Pozitivní

plasmidová DNA Bb bez současné přítomnosti genomové DNA BB nás upozorňuje na dvě

siutace. Jednak na možnou aktivaci chronického procesu po kterém přichází relapsu se

spirotchetémií, ale stejně tak může jít o situaci,kdy byla teraupeticky úspěšně zvládnuta léčba

a spirochéty byly degradovány a vypuzeny z krevního oběhu.Citlivost reakce jednokrokové

PCR byla optimalizována na maximum. Citlivější OSPA primer může identifikovat 20-40

fentogramů plasmidové DNA BB, genomový primer 16S rRNA odvozený z geneticky

stabilního genu prokáže 40-400 fentogramů specifické DNA. Vybraný genomový primer

prokáže příbuznou sekvenci koliformních bakterií až při stotisíckrát vyšší koncentraci (od 40

ng), která nepřichází v nekontaminovaných tělních tekutinách v úvahu.Největší riziko je

v tomto směru při izolaci DNA ze slin, stolice, moče a kontaminované vody. Větší citlivost

vybraného primeru OSPA k sekvencím Borrelia burgdorferi sensu strictu upozorní při reakci

na možnost,že jde o DNA právě tohoto genomospeciés. Pro skreenigovou analýzu produktů

amplifikace na agarozovém gelu je u zvolených primerů výhodná i velikost produktů. U

produktu geonomové DNA je to 357 bp a u plasmidové DNA pak velikost 448 bp. Velikost

produktu je výhodná pro snadný odečet i pro odlišení obou produktů vedle sebe.Produkt

amplifikace primerů PC3 a PC4 je pouze 110 bp. Nízká poloha tohoto produktu může

působit problém při odečítání.Tomu se dá odpomoci použitím koncetrovanější agarózy (2-4 %

w/v) nebo použitím speciálního druhu agarózy. Produkty amplifikace se dají verifikovat

hybridizační sondou i restrikční analýzou a sekvenací. My jsme využili možnosti pozitivní

vzorky potvrdit sekvenací Metoda horkého startu PCR zvyšuje specifitu produktů, použití

vybrané apyrogenní ředící vody bez přítomnosti rezidují genomu koliformních bakterií

snižuje riziko nespecifických reakcí. Výběr optimální teploty annilingu pomocí cykleru s T

gradientem a využití doporučení pro multiplex PCR umožnilo definovat optimální metodiku

pro stanovení přítomnosti DNA Bb ve vzorcích u pacientů s akutní fází lymeské borreliózy a

při relapsech tohoto onemocnění.Příprava DNA alkalickou lýzou se ukázala jako výtěžnější

při přípravě především plasmidové DNA i přesto, že bylo možné použít maxilálně 15 %

takto získaného templátu v PCR směsi.Templáty z alkalické lýzy je však nutné uchovávat

výhradně při teplotě -70 a nižší. U obou způsobu přípravy DNA je izolována nerovnoměrná

směs nukleových kyselin, jak genomové tak plasmidové DNA i RNA. Nepoužije-li se při

přípravě RNáza k rozštěpení zároveň izolované RNA může dojít ke snížení citlivosti

reakce,většinou však jen u vzorků z tkání.Zatím z experimentálně nepotvrzeného pozorování,

se zdá,že prostorové uspořádání izolované DNA má vliv na její další použití a vyžaduje jistý

způsob zacházení s templátem . Pro většinu rutinní praxe postačí, když templát bude použit

pro amplifikaci co nejdříve po šetrné homogenizaci složek v roztoku . Při stanovení

optimálního teplotního profilu pro amplifikaci v cykleru jsme použili výsledky zkoušek

provedených na přístroji s programem pro teplotní gradient. Pro genomový primer stanovili

jeho autoři anilingovou teplotu na 47 ºC. U plasmidového setu pak určili teplotu annilingu na

hodnotu 68 ºC. Podle pokusů jsme určili jako optimum hodnotu 57 ºC,kdy docházelo

k vytvoření stejného množství produktu obou setů primeru již po 30 cyklech reakce. Navíc

bylo nutné při prodloužit dobu annilingu na 90 vteřin jak je běžné u multiplex PCR. Snížení

teploty elongace z 72 ºC na 70 ºC ještě zvýšilo citlivost reakce,přičemž tato teplota již

neuvolňuje většinu nově připojených nukleotidů z předchozího kroku. Naopak zvýšení teploty

závěrečné elongace na běžných 72 º umožní jednak ještě prodloužit specificky a pevně

připojené řetězce a zbavit se nepevných připojení a často nespecifických produktů reakce.

V diagnostice DNA Bb se často využívá nested PCR. Tato metoda je citlivější a mnohdy i

specifičtější než jednokroková PCR. Bohužel má též jednu zásadní nevýhodu. I při zavedení

všech způsobů ochrany před kontaminací prostředí při nested PCR dochází v laboratořích,

které zpracovávají větší množství materiálu časem ke kontaminaci prostředí a k falešně

pozitivním výsledkům, které nelze odlišit ani následnou analýzou produktu..Tak může tato

metoda ztratil lehce svoji diagnostickou hodnotu. V další části práce bude nutné věnovat

srovnání výsledků získaných z nested PCR a z navrženého postupu. Také bude nutné doplnit

práci o výsledky ze zpracování materiálu od statisticky hodnotitelného množství zdravých

krevních dárců.



















Literatura:

1 Manak,M.M.,Gonsales-Villasenor,L.I.,Aush-Stantore,S., and Tilton,R.C.,
Use of PCR Essay to Monitor the Clearence of Borrelia burgdorferi DNA from Blood Following Antibiotic Therapy
Journal of Spirochetal and Tick-borne Diseases,Vol.4,Num.1/2,Spring/Summer,1997

2 Marconi T.R.,Garon,C.F.,
Development of Polymerace Chain Reaction Primer Sets for Diagnosis of Lyme Disease and for Species-Specific Identification of Lyme Disease Isolates by 16S rRNA Signature Nukleotide Analysis
Journal of Clinical Mikrobiology,Vol.30,No.11,Nov.1992,p.2830-2834

3 Priem,S.,Rittig,M.G.,Kamradt,T.,Burmester,G.R., and Krause,A.,
A Optimized PCR Leads to Rapid and Highly Sensitive Detection of Borrelia burgdorferi in Patiens with Lyme Borreliosis
Journal of Clinical Mikrobiology, Vol.35,No.3,Mar.1997, p.685-69x


4 Saiki,R.K.,Bugawan,T.L.,Horn,G.T.,Mullis,K.B.,Erich,H.A.,
Analysis of Enzymatically Aplified Beta-Globulin and HLA-DQ Alfa DNA with Allene-Specific oligonucleotide Probes
Nature,1986,324, p.163-166

5 Schmidt,B.L.,
PCR in Laboratory Diagnosis of Human Borrelia burgdorferi Infections,
Clinical Mikrobiology Reviews,Vol.10,No.1,Jan.1997,p.185-201
























Tabulka 1.

Množství spirochét ve vyšetřovaném materiálu nemocného jedince a

nejnižší počet pro úspěšnou izolaci DNA [5.Schmidt, 1997]


Druh materiálu Počet spirochét v materiálu
v ml Nejnižší počet spirochét
pro izolaci DNA v ml
Infikované klíště 4 500-55 000 /jedinci ?(10)
Krevní plasma Pod 50 10
Krevní plasma u pacientů s erythema migrans 4000 10
Moč Pod 50 50
Výpotek kloubní 5000-10000 10
Mozkomíšní mok 1-20 10
Plná krev Pod 50 100
Krevní sérum Pod 50 50































Tabulka 2:Program pro cykler:

krok Aktivace
polymerázy PCR multiplex
Plastidová a genomová DNA Závěrečné
prodloužení

jedenkrát
Denaturace Připojení Prodloužení
jedenkrát
Třicetkrát –
teplota 95ºC 94ºC 57ºC 70º C 72ºC
čas 15 minut 60 vteřin 90 vteřin 90 vteřin 10 minut









































Tabulka č.3

Pozitivita zkoušeného materiálu pomocí multiplex PCR.

Materiál Pozitivní negativní % pozitivity alespoň jednoho primeru u všech vzorků % pozitivity obou primerů u pozitivních vzorků
Krev 255 2244 10,20 % 25 %
Mok 253 2274 10,01 % 30,4 %
Punktát 43 86 33,33 % 19,76 %
Tkáň 10 33 23,25 % 6,06 %































Tabulka 4.: Test specifity primerů používaných pro identifikaci DNA Borrelia

burgdorferi sensu lato . při multiplex PCR za použití DNA různých bakterií

Sbírkový mikrooragnismus Označení kmene )* OSPA
Mannak 1997 LD
Marconi
1992
Bacillus cereus Bc 8/78 - -
Corynebacterium murium Cor 35/70 - +-***
Enterobacter aerogens Ae 1/43 - -
Escherichia coli EcK 141/59 - +-***
Klebsiella ozaenae Klo 1/35 - -
Micrococcus luteus M 8/58 - -
Proteus hauseri PrK 4/57 - -
Proteus morganii Prm 1/37 - -
Proteus mirabilis Prmi 26/77 - -
Pseudomonas aeruginosa Ps 37/65 - -
Serratia marcescens Sr 20/61 - -
Staphylococcus aureus Mau 1/45 - -
Yersinia enterocolitica Y 1/64 - -
Candida albicans 55/79 - -
Borrelia burgdorferi s.s. B 31 )x + +
Borrelia garinii M192 ) x - +
Borrelia afzelii Kc90 )x - +
Borrelia valaisiana )x - +
Borrelia hermsii 1), 2),** - -
Borrelia anserina 1),** ? -
Borrelia coriaceae 1)** ? -
Borrelia parkeri 1)** ? -
Borrelia turicatae 1)** ? -

)* CNCTC –Czechoslovak National Collection of Type Cultures,SZÚ Praha

)x Národní referenční laboratoř pro lymeskou borreliózu ,CEM,SZÚ Praha

)** Zkoušku specifiky primerů provedli autoři uvedení v citaci pod čísly
)*** Slabá reakce jen při nadbytku bakteriální DNA .Specifitu lze vyloučit následnou identifikací produktu PCR, nejlépe druhově specifickou sondou
? výsledek zkoušky neznámý
+- stopová hraniční pozitivita
+ pozitivní reakce
obsah: Copyright © 2008 Jíří Antonín Votýpka ; redakční systém: Copyright © 2008 Yotto.cz