JA.WEBZDARMA.CZ - Texty - Westernblot pro lymeskou borreliózu - poznámky
Westernblot pro lymeskou borreliózu - poznámky
Naposledy upraveno: 16.03.2011 19:19:58

Imunoblot v diagnostice lymeské borreliózy – poznámky laboranta..

Mezi laickou veřejností především mezi pacienty u kterých je podezření na lymeskou borreliózu ne vždy správně hodnotí význam diagnostického vyšetření specifických protilátek v jejich materiálu.V roce 1995 jsem měl možnost pod vedením Dr.D.Hulínské,CSc(NRL SZÚ Praha) provádět srovnání různých imunoblotů s antigeny původce lymeské borreliózy. Než jsem začal pracovat v molekulárně-genetické diagnostice lymy ve stejné laboratoři bylo mi umožněno provádět řadu srovnání a podílet se na přípravě diagnostických roztoků pro WesternBlot pro borrelie.




Komerční test monoklonální


Pro pacienty a ty kteří se zabývají hodnocením zmíněného imunoblotu uvádím zde některé mé poznámky:

Imunoblot je velmi dobrou pomůckou pro potvrzení přítomnosti Borrelia burgdorferi v organismu.
Jeho citlivost a specificita je vyšší než další serologické testy (ELISA,IFA).Má to však řadu ale:
1.Problematika použitého antigenu kde je nebezpečí:
a)Použití neaktuálního kmene borrelií ,většinou sbírkového,dlouhodobě uchovávaného a pasážovaného v umělém kultivačním mediu.Antigeny čerstvě izolovaného kmene od pacienta který měl prokazatelně pathogenní sérotyp s typickou klinikou mohou být částečně ale i výrazně jiné.Navíc jsou rozdíly u jednotlivých genomospeciés (B.garinii, B.afzelii,B.burgdorferi, aj)
b)Příprava antigenu má řadu kritických bodů: je nutné dodržet naprosto přesně kultivační podmínky jako je teplota,tenze CO2,objem kultivačních nádob a standartně určená denzita media po koltivaci (množství narostlých bakterií) a použití kultury v optimální exponenciální fázy růstu.Také podmínky koncentrace bakteriálních těl (, promývání,počet otáček,teplota) a jejich desintegrace (intenzita UV sonifikace, chlazení).
c)Velmi náročná je další fáze přípravy elektroforéza a blotování antigenů.Je třeba zajistit okamžité použití suspenze pro přípravu materiálu pro vertikální eletroforézu antigenů,nebo antigen uchovávat za podmínek, které neovlivní jeho kvalitu.(např.uchovávání při teplotě pod -70C) Navíc může ovlivnit rozdělení antigenů použité barvivo,markr i průběh akrylamidové elektroforézy a druh použitého markru bílkoviných frakcí.Elekroforéza ovlivňuje pravidelné a dostatečné rozdělení jednotlivých stop anigenů tak aby byly srovnatelné s kontrolami.Stejně důležitý je procest blotování tj. Přenost anigenů na měmbránu pomocí eletrického proudu. Přesnost reakce má vliv na kvalitu detekčních proužků, především na jejich intezitu.
d)Problémem následně při použití jednotlivých blotů může být i kvalita detekčních roztoků , jejich složek a a přesný postup diagnostického testu. (pH,teplota,čas)
e)Samostatným problémem je kvalita zkouišených vzorků. Starší materiál a materiál hemolytický, přítomnost některých farmak může ovlivnit. Navíc je často třeba upravit reaktivitu blotů tzv.vysycením proti falešně pozitivním reakcím s nespecifickými bílkovinami.




WB lyma laboratoř Dr.Hulínské SZÚ Praha, testy v roce 1995.

f)Samotný odečet výsledků patří do rukou zkušených odborníků, kteří mají zkušenost s odečítáním výsledků u používaného glotu. Bloty různých výrobců se totiž liší i zcela diametrálně jak v citlivosti tak ve specifitě.V tomto směru se názory tak liší, že byl proveden pokus o sjednocení výsledků a doporučení pro použití v Evropě.

http://jcm.asm.org /cgi/content/full/38/6/2097


Podrobný popis všech odchylek pak způsobil naprostý zmatek u praktiků, testy se staly nejednoznačné a proto jim řada praktiků nedůvěřuje.




Imunoblot různých kmenů B.burgdorferi ve třídách IgM a IgG Laboratoř dr.Hulínské SZÚ Praha


g)Rozdílné typy komerčních blotů se liší i při použití komplexních antigenů (těl borrelií) a blotů, které používají monoklonální antigeny(uměle připravené produkčními kmeny jiných rodů a druhů), které jsou na pohled jednoznačné a citlivější. Je to však většinou problematické, neboť jsou tím více nespecifické a příliš citlivé. Jiné takové bloty jsou zase pro použitý vybraný antigen mnohdy i falešně negativní.
h)Když porovnáme bloty používané i u jiných onemocnění je prvním dojmem i to, že jsou si velmi podobné a při určité jejich nekvalitě a nejednoznačnému označení antigenů jednotlivých bílkovin z těl bakterií a virů i zdánlivě zaměnitelné.



Vliv kultivačních podmínek v nichž vznikají antigeny k testování lymeské borrerliózy

Proto odečet blotů patří jen do rukou zkušených odborníků, kteří pracují s velkým množstvím vzorků ve specializované laboratoři.




na obrázku Western Blot pro diagnostiku onemocnění HIV (AIDS)- všimejte si jednotlivých bendů a srovnejte je s WB např. pro lymu.

Schémat na odečet je v příbalových letácích otištěno mnoho. Tento materiál v rukou pacientů je problematický. Odborník odečítající výsledek dává také zřeten na to jak intezivní je bend jednotlivých antigenů a srovnává i kontrolní blot každé šarže, kde se mohou výsledky částečně lišit i používá zkušenost z odečtu velkého množství testů které v minulosti odečetl.Výroba blotů téměř všude je spíše manfakturní a musí vycházet i z variability biologického materiálu. Podle toho vypadají pak i výsledky.

Pro orientaci zde uvádím standardní schéma westernblotu pro antigeny Borrelia burgdorferi – základní, starší ale také jednoduché a spolehlivé:

IgM imunoblot je pozitivní jsou-li 2 z tří následujícíh pruhů (bendů):

24 kd (=OspC)
39 kd (=BmpA)
41 kd (=Fla)

IgG imunoblot je pozitivní když je 5 z 10 následujících pruhů(bendů):

18 kd (=OspE)
21 kd (=OspC)
28 kd (=OspF)
30 kd (=OspA)
39 kd (=BmpA)
41 kd (=Fla)
45 kd (=GroEL?)
58 kd (=OspD)
66 kd
93 kd

(Citace z: Proceedings of the Socond National Conference on Serologic Diagnosis of Lyme Disease 12,pg 2,3, in Charles Ellen Bogen,MD, Fayetteville,NC 1601 Owen Dr.Fayetteville,NC 28304
obsah: Copyright © 2008 Jíří Antonín Votýpka ; redakční systém: Copyright © 2008 Yotto.cz